近年來,ELISA技術取得了顯著的發展,主要表現在以下方面:
1、繼單克隆抗體后的第三代抗體基因工程抗體的應用,明顯地提高了檢測的特異性,基本消除了抗原、抗體間的非特異反應,保證了分析的準確性??贵w制備技術的進步,使試劑的生產制備得以規?;?,檢測范圍日益擴展,小分子抗原、半抗原的檢測成為事實。
2、分析方式的改進與多樣化提高了試驗的敏感性。
(1)除早期的競爭法,間接法外,又發展了雙抗原夾心法測抗體,偶聯酶標記法測抗原,橋聯酶免疫分析,酶放大免疫分析技術等,后者應用了親和素系統,底物循環放大系統,酶-抗酶放大系統及酶偶聯放大系統等。
(2)由于酶標記技術的進步,標記酶的應用已從過氧化物酶,擴展到堿性磷酸酶,β半乳糖苷酶,尿素酶,葡萄糖6磷酸脫氫酶,葡萄糖氧化酶,蘋果酸脫氫酶,至今有二十多種酶被應用于ELISA ,但應用比較多的仍然是辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)和堿性磷酸酶(Alkalinephasphotase,ALP)。
(3)改進固相載體的技術
傳統ELISA應用的固相載體是聚苯乙稀微孔板,聚苯乙烯珠或條,后發展為硝酸纖維素膜、活化濾紙、硅片、尼龍、利用高分子材料合成的各種固相微粒等。為提高固相表面的結合容量,增加結合物的范圍而改造聚苯乙烯的表面,如用化學偶聯法導入功能性醛基、?;?、烷胺基等以更好地與蛋白質,多肽的羧基結合,用位點導向性共價偶聯法引入親和素,蛋白A,多聚賴氨酸等,以牢固地捕獲蛋白或多肽,超平整聚苯乙烯表面的制備,克服了表面粗糙帶來的不均一性,達到平均粗糙度只有2A+的超平整平面,實現了對蛋白的結合容量大,脫附率低,孔間均一性好,使試驗精密度達5%。
應用于雙抗體夾心法時,聚苯乙烯經射線照射后,可以增加其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能。近年美國Corning公司研制成功表面經琥珀酰亞胺酯活化酶標板,其質量達到氨基活化相似水平。